Międzynarodowy zespół naukowców pod przewodnictwem Uniwersytetu w Uppsali opracował bardzo wydajną metodę obrazowania cząsteczek przy użyciu lasera rentgenowskiego. Wykonano w ten sposób zdjęcie karboksysomu – niewielkiej struktury obecnej u bakterii przeprowadzających fotosyntezę.
Rys.1 Ikozahedralna struktura karboksysomów, prawa autorskie: SLAC National Accelerator Laboratory
Eksperyment opisany w artykule opublikowanym w czasopiśmie naukowym Nature Photonics[1] to przełom w badaniu struktur biologicznych z wykorzystaniem laserów rentgenowskich. Technika otwiera drogę do trójwymiarowego obrazowania organelli komórkowych, a nawet małych wirusów.
Do testowania tej metody, naukowcy z Uniwersytetu w Uppsali, podobnie jak badacze z innych instytucji, wykorzystali karboksysomy. Są to organella cyjanobakterii asymilujące dwutlenek węgla – zawierają białka przekształcające dwutlenek węgla w związki organiczne. Karboksysomy są bardzo małe – ich średnica wynosi 115 nm, co nie pozwala zobaczyć ich za pomocą mikroskopu optycznego.
Przy pomocy specjalnego wtryskiwacza wytwarzającego strumień cząstek cieńszy od ludzkiego włosa, naukowcy rozpylali aerozol zawierający karboksysomy w poprzek wiązki promieniowania rentgenowskiego emitowanego z lasera LCLS. Opisane doświadczenie zostało przeprowadzone w Stanford Linear Accelerator Center w USA. Naukowcom udało się oszacować strukturę organelli analizując sposób w jaki karboksysomy rozpraszają promieniowanie rentgenowskie. Do tej pory w ten sposób możliwe było badanie jedynie substancji krystalicznych. Dzięki ekstremalnej jasności lasera LCLS możliwe jest badanie substancji niektystalicznych, w tym materiałów biologicznych.
W ciągu 12 minut naukowcy zbadali 70 000 widm poszczególnych cząstek. Uzyskane wyniki badań potwierdziły ikozahedralny kształt (struktura złożona z 20 trójkątnych ścian) karboksysomów. Wyniki ukazały również znaczne różnice w wielkości tych organelli.
„Nasza metoda umożliwia obrazowanie pojedynczych cząstek obiektów, które mogą być różne w wielkości i kształcie”, mówi Max Hantke, doktorant biofizyki molekularnej na Uniwersytecie w Uppsali.
Przed obejrzeniem próbek w mikroskopie elektronowym należy je zamrozić. Lasery emitujące promieniowanie rentgenowskie (LCLS, XFEL) pozwalają na przeprowadzenie analizy bez konieczności zamrażania. Metoda oferuje również możliwość oglądania całych komórek żywych w niespotykanej dotąd rozdzielczości.
„Karboksysomy to najmniejsze cząstki kiedykolwiek sfotografowane laserem rentgenowskim. Widoczne są szczegóły o wielkości 18nm. Możemy oglądać obiekty takie jak wirus HIV, opryszczki,” mówi Max Hantke.
„Stworzyliśmy podstawy dla dokładnego ustalania struktury obiektów przez nowy sposób obrazowania, możemy śledzić budowę i niejednorodność struktur biologicznych”, mówi profesor Janos Hajdu. „Jesteśmy w stanie dokładnie obliczyć wielkość struktur, tak jak w przypadku zróżnicowanych karboksysomów,” dodaje Max Hantke, sugerując, że sfotografowane organelle pozostały nienaruszone.
Na skutek działania intensywnego promieniowania rentgenowskiego próbki ulegają zniszczeniu. Możliwe jest jednak otrzymanie dokładnego obrazu przed ich dezintegracją. Ta metoda zwana „dyfrakcją przed destrukcją” została zaproponowana w 2000 roku przez grupę z Uppsali.
Obrazowanie pojedynczych cząstek będzie możliwe w XFEL w 2017r. Do badań będą używane dwa rodzaje urządzeń: narzędzie SPB (pojedyncze cząsteczki i biomolekuły) oraz narzędzie SFX (seryjna krystalografia femtosekundowa), które będą wyposażone we wtryskiwacz stosowany w opisanym eksperymencie. Laser XFEL będzie wytwarzał 27 000 wiązek rentgenowskich na sekundę o większej intensywności niż dotychczas.
„W biologii występuje zróżnicowanie na wszystkich poziomach, chcemy wykorzystywać tę metodę na poziomie komórkowym,” mówi Janos Hajdu. „Jesteśmy na dobrej drodze, badania te pomogą nam w stworzeniu trójwymiarowego obrazu struktur z rozdzielczością atomową,” dodaje Max Hantke.
„Wyniki badań pokazują drogę do obrazowania próbek w wysokiej przepustowości i rozdzielczości. Możliwość uzyskania dużej ilości danych w krótkim czasie pozwala na studiowanie dynamiki cząstek i analizę zmian strukturalnych, które są niezwykle ważne dla życia,” mówi Filipe Maia, opiekun Maxa Hantke.
- Max F. Hantke, Dirk Hasse, Filipe R. N. C. Maia, Tomas Ekeberg, Katja John, Martin Svenda, N. Duane Loh, Andrew V. Martin, Nicusor Timneanu, Daniel S. D. Larsson, Gijs van der Schot, Gunilla H. Carlsson, Margareta Ingelman, Jakob Andreasson, Daniel Westphal, Mengning Liang, Francesco Stellato, Daniel P. DePonte, Robert Hartmann, Nils Kimmel, Richard A. Kirian, M. Marvin Seibert, Kerstin Mühlig, Sebastian Schorb, Ken Ferguson, Christoph Bostedt, Sebastian Carron, John D. Bozek, Daniel Rolles, Artem Rudenko, Sascha Epp, Henry N. Chapman, Anton Barty, Janos Hajdu, Inger Andersson. High-throughput imaging of heterogeneous cell organelles with an X-ray laser. Nature Photonics, 2014; DOI: 10.1038/NPHOTON.2014.270
- http://www.sciencedaily.com/releases/2014/11/141117130729.htm
Opracowała: Olga Polakowska
Korekta: Ilona Sadok
